一、实验原理将油菜的外植体如下胚轴、子叶与农杆菌共培养在共培养过程中农杆菌会附着在油菜外植体细胞的表面并将 T-DNA 转移到油菜细胞中。T-DNA 携带的目的基因会随机整合到油菜细胞的基因组中。最后利用植物细胞的全能性通过组织培养技术将转化后的油菜细胞培养、再生为完整的转基因油菜植株。二、实验目的通过农杆菌介导等技术将目的基因导入油菜细胞经组织培养获得目标性状稳定表达的转基因油菜植株以用于基因功能研究、品种改良或生物制品生产等。三、实验步骤1.农杆菌准备1质粒转化吸取测序正确的质粒 10μL转入农杆菌感受态细胞中。冰上 30min液氮冷冻 1min加入液体 LB 1mL。放入摇床 28℃,120r/min 培养 4h集菌使用涂布器涂在具有 K/R 抗性的培养基上放入 28℃烘箱培养 2 天。将培养后的农杆菌拿出挑选单菌落划线一天后刮取菌落过夜培养 28℃,210r/min而后使用甘油 300μL菌液 700μL混合后放入液氮冷冻存入-80℃冰箱。2农杆菌检测合成相应的检测引物如下表所示配制 PCR 扩增体系完成配制后充分混匀使用 PCR 仪进行扩增PCR 程序95℃预变性 5min循环体系为 95℃变性 30s、58℃退火 30s、72℃延伸 2k/min、 35 个循环72℃延伸 10min16℃保存1%琼脂糖胶体系1.5g 琼脂粉加入 150mL1×TAE 溶液放入微波炉加热至完全溶解冷却后加入核酸染料制备凝胶冷却后点样完成电泳过程PCR 扩增结果查看阳性对照及样品的电泳条带清晰、大小正确且阴性对照均无条带的情况下表明该样品可进入下一步骤。2.油菜遗传转化1种子消毒取 50 mL 离心管装种子用 75%的酒精浸泡种子摇晃 90 s84 消毒液和超纯水的比例是 1:2加一滴吐温-20摇床 23℃ 180 rpm 30 min倒出液体超纯水洗 8-10 次播种在 M0 培养基上。2准备外植体将消毒后油菜种子接种于无菌萌发培养基暗培养 6 天在超净工作台中用无菌剪刀将子叶部分切除剪取油菜下胚轴。3侵染及共培养活化培养50 mL 离心管中加 5 mL LB 加入 100 µL 目标农杆菌28℃ 220 rpm 培养约 14-16h侵染处理剪取油菜下胚轴加入 18 mL DMAS每个外植体长度平均 0.8-1 cm使用分光光度计检测菌液浓度 OD600 0.4-0.6 可进行集菌操作先在DM 培养基中加入 AS摇匀。用大枪取 2 mL 菌液于无菌 2 mL 离心管中做好标记离心 6000 rpm3 min倒出上清液加入 2 mL DMAS先用 1 mL 吹打混匀再补加 1 mL离心 6000 rpm3 min倒出上清液加入 2 mL DMAS先用 1 mL 吹打混匀再补加 1 mL暂存于 4℃冰箱中待切苗结束后直接使用在剪好的外植体皿中倒入 2 mL 已完成集菌的DM 菌液侵染 10 min隔段时间要换一次4-5 次即可用移液枪吸空所有菌液再用无菌镊子夹取外植体到无菌滤纸上放置以吸走外植体多余的菌液共培养将侵染后的外植体接种于含 AS 的 MS 共培养基22-24℃、黑暗条件下培养 1 d避免农杆菌过度增殖。4筛选芽诱导脱菌后的外植体在筛选培养基上继续培养约 2-3 周后形成绿色抗性芽原基。5分化芽分化将抗性芽原基转移至芽分化培养基培养 3-4 周诱导不定芽分化。6生根生根培养当不定芽长至 2-3cm 时切下芽苗接种于生根培养基培养 1-2 周诱导形成健壮根系获得完整再生植株。注在此期间对小苗进行基因组 DNA 的提取和 PCR 鉴定以及提取 RNA 和荧光定量分析。3.转基因植株验证1PCR 检测提取转基因植株基因组 DNA用载体特异性引物扩增抗性基因引物示例Kan-F:5′-GTCGCTGTAGGTATCGCTATTG-3′,kan-R: 5′-GTTTACGCGTTGCTTCCGCCA-3′电泳验证目标条带。选择获得抗性基因的阳性株系检测敲除在 CRISPR 编辑位点前后设计引物进行测序检验敲除情况。2qPCR 检测表达量针对待测基因设置 3 对引物进行 qPCR 检测以确定合适的扩增引物。设计三对引物检测目标基因表达量变化对比野生型。3Sanger测序提取基因组后送 Sanger 测序。
